理论基础

聚合酶链式反应作为一种革命性的方法在生物学研究的历史中占据了重要的地位。以此为基础发展出包括real-time PCR在内的多项应用技术。自诞生后real-time PCR技术持续发展，从简单的增扩到整个PCR过程，real-time PCR表现出比PCR更敏感、更明确的定量分析特性和对识别等位基因的能力。

不少人以为real-time就是意味着可以在显示器上看到每个循环增扩曲线的增长。事实并非如此，早期的软件不能在运行期间提供可视化的增扩曲线。主要是因为SDS软件采用整个平台终的数据执行数据分析工作，而不是分析每个单独的反应循环。对某些设备来说，必须向分析软件提供实时的终的数据，有些设备则不需要。前一种设备允许软件实时跟踪每个加样口的增扩曲线，同时显示在电脑屏幕上。Real-time PCR其实是一种real-time设备。

RNA定量分析依靠逆转录酶制作cDNA（complementary DNA）。常见的逆转录酶有2种，AMV和MMLV。AMV是一种鸟类myeloblastosis病毒的二聚体蛋白质，MMLV来自于鼠科leukemia病毒的monomeric蛋白。2种酶都有RNase把RNA变性为RNA-DNA杂交体的活性，比较而言AMV有更高的RNase H活性。RNase H活性和依赖于RNA的DNA聚合酶活性能被mutagenesis区分开来。更重要的是每个AMV能把较多的分子聚拢在一起，推动增扩反应的进行。原生的AMV有高于MMLV的适用温度，42˚C对37˚C。修改后的变种可以有更高的温度极限，分别是AMV58˚C，MMLV55˚C。

按照以上的描述，大家可能认为改造后的AMV是适宜从RNA制作cDNA的酶。然而，在实际使用中经改造的MMLV工作的较好。其中的原因目前仍不明，猜测高温破坏了2种酶的聚合酶活性，但残留的DNA绑定活性对Taq polymerase形成物理障碍。二聚体构象和较高的温度极限也许使得AMV表现不佳。出于这个原因应在实验中尽可能少的使用逆转录酶。需要强调的是即使没有引物cDNA仍然能被逆转录反应制造出来，RNA模板的二级结构可能自我引发反应。有3种方法可以准备逆转录反应：oligo-dT，random primers or assay-specific primers。其中oligo-dT的使用较广泛，它使用mRNAs作为模板。但是不是所有mRNA都有poly-A尾，大的问题是oligo-dT把增扩区域限制在了mRNA poly-A 尾的附近。当转录较长的片段时（<500bp）反应开始于3’ UTR。这样的结果有高的忠实性，也意味着增扩出的序列可能不会跨过一个外显子连接。对于有些实验，3’ UTR富含不利于PCR实验的A/T碱基。因此使用自由引物制造转录序列放弃3’ UTR，但自由引物也同时会制造核糖体和transfer RNAs的cDNA，出现大量且复杂的cDNA。第三种方法是使用针对每个实验的引物（assay-specific primers），理论上讲这种引物满足转录目标序列的要求，得到相应的cDNA产物。

Real-time PCR反应增扩子的大长度大约在250 bases，从前面的讨论可知assay-specific primers是大多数实验较佳的选择。但是assay-specific primers有2个明显的缺点，每次PCR反应使用较多的RNA样本，不能用于一台仪器上同时处理几种样本的反应。注意根据实验需要合理的选择引物，安排实验计划。

现代PCR反应的核心是耐热DNA聚合酶，常用的是Thermus aquaticus也称Taq。野生型Taq是依赖DNA从5->3合成的，具有3->5校对功能的聚合酶，它也有5’-nuclease的活性。Real-time PCR常用变异后移除校对功能的品种。市场上有2种版本的Taq，修改后的Taq和热启动（hot start）Taq。

现今市场上的real-time PCR设备均使用荧光剂作为信号源，荧光的强度随着增扩产物的增加而成比例的增长。荧光剂分子吸收光线中狭小波长的光子，能被染料吸收的光线叫做激发波长。激发后的分子处于较高的能量状态，持续时间很短，分子迅速衰退到原先的状态。在这个过程中一个光子以较长的波长发散出来，对于每一个荧光染料都有一个优化的激发和发散波长。在狭窄的优化波长范围内，荧光分子能被激发或检测到。荧光实验主要要求在初和后的10个PCR循环中信号强度有尽可能大的差异。个荧光剂染料分子（donor或reporter）由外部的优化波长光线激活后，释放出较长波的光线去激活临近的另一个分子（acceptor），这样的过程称为三角洲。接受光线的分子可能会也可能不会释放出光线。每一次的转发过程都会使波长有所增加，直至real-time设备能接收到。Real-time PCR的荧光剂按照功能区分有3个类型，1. Donor发散出的荧光信号在实验过程中被检测到。2. Acceptor负责冷却Donor发出的信号。3. 是参照染料，参照染料不与其他成分产生反应，软件用它校正不同加样孔的信号。理论上讲，荧光剂染料可以成为reporter。常见的染料有6-FAM (6-carboxy fluorescein)和YBR® Green I，前一种能被由氩离子激光制造的488 nm的波长激发。6-FAM容易和寡核苷酸结合释放出一个强信号。YBR® Green I与6-FAM不同，是一种自由染料。

冷却分子可以是荧光染料也可以是其他能吸收恰当波长的光线能量的分子，原来和6-FAM一起使用的是TAMRA (6-carboxy-tetramethylrhodamine)。FAM在靠近TAMAR的位置上有效地吸收光子能量。除此之外，不发光的黑色染料也可用于reporter。常见的有DABSYL (4-(dimethylamino)azobenzene-4’-sulfonyl chloride)。参照组的荧光信号比较每个加样孔的不同，保证每个加样孔的信号在整体上较平稳。设备上的不同会形成加样孔之间数值的偏差，叫做“边缘效应”，要求对每个加样孔的数值标准化。但是当边缘效应过大，内侧加样孔和外侧加样孔的差距过大就不再适合参照组作为标准化的依据。常见的参照染料是ROX (6-carboxy-X-rhodamine)

Real-time PCR设备组成

介绍市场上全部real-time PCR的使用不是明智的事，但是知道基本常识，了解设备如何工作，设备结构和物理限制还是有必要的。Real-time PCR有3大部分，光源：这决定了荧光染料的范围，探测系统：决定了光谱范围和敏感度。热循环机制：决定了每次实验的速度，样本间统一的温度变化，样本数量。

Real-time PCR的光源有4种，氩离子激光，LED激光，石英卤素钨灯和氙灯。每一种不同的光源决定了设备的工作能力，氩离子激光主要的工作光谱在488 nm，对reporter来讲是个的波长。但在红光下488 nm给出一个较弱的染料激发，*过大的500 nm时伴随弱化的信号。较弱的信号限制reporter 染料的效用。LED激光发出30-40 nm的光线，输出的能量比氩离子激光微弱，但能源使用费用较低。常用光源是石英卤素钨灯，这种灯泡能发射出稳定的360 nm至1000nm波长的光线，覆盖全部可见光，有时也叫“白光”。与以上提到的激光不同，需使用2组激发和散射滤镜来选择使用的波长，有些设备使用光电倍增管和CCD摄像机捕获信号。氙灯的亮度远高于石英卤素钨灯，波长与其相似。使用5组激发滤镜和2组散发滤镜。

发展趋势

Real-time PCR呈现出3个发展方向

1.   初的real-time PCR只能处理单一的样本，现在越来越多的设备具有更广阔的运行能力，许多设备可以提供5至6个新颖的激发/发散滤镜。理论上讲，每个反应可以允许5至6个不同的样本同时实验。每个reporter释放出的光线按物理手段分开，

2.   Real-time PCR设备执行热循环的能力加强了， 可装入的样本数量增加，化学试剂的改进缩短了了每次运行的时间，缩短时间对于高通量用户是重要的性能指标。

3.   提高样本产量。目前产量高的real-time PCR是ABI 7900能够一次装入384个样本，这种容量已经*出一般实验室的需求。但对某些用户来来讲，更高产的设备1536个样本处理能力成为标准配置。