1、变性

90～94℃的高温处理可使模板 DNA 双链间氢键断裂,解离成单链但不改变其化学性质,变性的时间一般为30s,如果模板的 G+C 含量较高,变性时间可能延长。

2、退火

退火的温度一般降低至25～65℃。在退火过程中,引物分别与待扩增的 DNA 片段的两条链的3'端互补配对。退火的温度取决于引物的 T_m 值,并通过预备试验来最后确定。一般引物越短,其 T_m 也越低,对于10bp 左右的随机引物,退火温度在37℃左右,反之则高。退火温度越高,引物与模板结合的特异性增强,非特异性的扩增概率降低,但扩增效率也随之降低。相反,随着温度的降低,引物与模板非特异性结合的概率提高。引物的长度越长,其退火温度则越高,否则会发生非特异性结合,降低 PCR 产物对模板的忠实程度。退火时间一般为30s。

3、延伸

Taq DNA 聚合酶的最适温度为70～74℃,在此温度下 Taq DNA 聚合酶以单链 DNA 链为模板,将单核苷酸逐个加入到引物的3'端,使引物不断延长,从而合成新的 DNA 链。新合成的引物延伸链在下一轮循环时就可以作为模板。反应步骤的温度和时间可以根据实验要求自行设定,一般要经过20～30个循环,扩增产物需要经琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。